大咖说丨破伤风类毒】素「※（TT）质量研究

2023年08月28日

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疫苗是用于预防、治疗人类相应疾病的♂生物制品。疫苗◥接种人体后可刺激免疫系统产生特异性的细胞免疫或者ζ　体液免疫应答，从而获得相应病原微生物的免疫力。

疫苗可分为减毒活疫苗、灭活疫苗、亚单位疫苗（含多肽疫Ψ苗⊙）、重组蛋白疫苗、多□糖结合疫苗、病毒载体疫苗、核酸疫苗等。

CDE颁布的《预防用疫苗临床前研究技术指导原则》，针对采用传统ㄨ方法（灭活、减毒、分离提取）制备的▓预防用疫苗，就工作种子批毒种、纯化工艺阶段、半成品与成品阶段等明确提出质量研究控制的相】关要求，质量分析与控制始终是整个研发与生产过程中的重№中之重。随着疫苗产业的不断壮大，质量研究也是逐渐深入。

多糖结合疫苗 (glycoconjugate vaccines)是指具有可↓变结构和数量的多糖单元与非糖单元▅（蛋白质或短肽、脂类），通过共价连接形成的疫苗，以蛋白质-多糖结合疫苗为主。其中非糖单元作为载〗体，发挥类似佐剂的作用，激活』辅助性 T 细胞继而促进 B 细胞成熟分化形成记忆，从而提供长期∞免疫保护。

目前用于疫苗的载体蛋白⌒　有：白喉毒素的交ω　叉反应物 (cross-reactingmaterial, CRM197)、破伤风类◣毒素 (tetanus toxoid, TT)、白喉类毒素 (diphtheria toxoid, DT)、脑膜炎耐瑟球菌外膜蛋白复合物 (meningococcalouter membrane protein complex, OMPC) 、流感嗜血杆■菌蛋白 D (H. influenzae protein D, HiD) 、铜绿假单胞菌外毒素A (exotoxin A of Pseudomonas aeruginos, EPA)、艰难梭菌毒▽素 A (Costridium difficile toxin A, CDTA) 和毒素 B (Costridium difficile toxin B, CDTB)的无毒性肽段、肺炎球菌表面蛋白 A (pneumococcalsurface protein A, PspA)、肺炎球菌组氨酸三联蛋※白D (pneumococcal histidine triad D, PhtD)、脱毒的链球≡菌溶素 (detoxified pneumolysin, dPly) 和金︾黄色葡萄球菌 α-溶素 (Hla)等^[1]。

破︻伤风类毒素（TT）是由破伤风梭菌产生的一种强效神经毒素蛋白。由破伤♂风梭菌生产制备的破伤风疫苗自20世纪30年代开始使用，该疫苗经◥过甲醛脱毒处理的破伤风类♂毒素※（tetanus toxoid，TT）组成。TT蛋白还被广泛用作结合疫苗的载体蛋白，由于破伤风类毒↓素TT的免疫㊣　学特性，独立于T细胞▂的反应转变为依赖于T细胞的反应，从而增强了针对共轭细菌多糖的免疫原性。

通常情况下，基于结构决定功能的考虑，破伤风类毒素（TT）蛋白可以从△一级结构、高级结构、理化性质与生物学活性等方面∩进行质量研究。

表1 TT蛋白的质量研究列表

1·SEC-HPLC与SDS-PAGE纯度研究

在破伤风类毒素（TT）蛋白〓的制备过程中，甲醛脱毒处理过程会导致蛋白结合物的产生，脱毒剂与毒素＠分子，以及培养基中的其他蛋白分子可能会发生不同程度的交联反应，生成分子结构被改变了的单体，或交联形成二♀聚体或多聚体等。可以通过SDS-PAGE与SEC-HPLC正交【的技术分析手段来研究聚体与单体分布与◆相对含量，破伤风类毒素（TT）典型的纯度图谱如图1-2。另外，还可以根◇据TT蛋白的SDS-PAGE图谱结果，进一步对降解的条带做降解位点的深入研究。

图1 破伤风类毒素（TT）的SEC-HPLC色谱图^[2]

图2 SDS-PAGE结果图谱

（Mr：蛋白相对分子质量；M：蛋白质 Marker；1-5为不同批次破伤风类毒素样品）^[2]

2· AF4-UV-MALS-RI研究

破伤风类毒素（TT）蛋∮白与脱毒后的TT蛋白在分布和多分散性方卐面存在差异。可通过AF4-UV-MALS-RI（不√对称流场流分馏(AF4)结合多角度光散射(MALS)和RI检测器）检测分子量分布情况。TT是单※分散的（蓝色虚线测多分散性数值 Mw/Mn等于1）。脱毒后的TT蛋白是多分●散性（绿色虚线测得的Mw/Mn值等于1.3）。

图3 TT（蓝色）和脱毒后TT蛋白（绿色）的非对称场流分离（AF4）断口图谱^[3]

MALS典型图谱如图4所示，虚线峰表示相对分子量▲的质量分布，线越水平，产物分子量分布就越单分散，说明产品的均一性好。典型图谱中蓝色虚线显示Mw与TT理论相对分子量是一致的单分散蛋白，而脱毒后的破伤风类毒①素TT（绿色）虚线图谱显示为不同蛋白（多分散蛋白）的混合物，表明由于经甲醛脱毒工艺，使得蛋白间之间发生了相互交联，使得TT蛋白以单体、二聚体及多聚体形式存在▓。

图4 破伤风类毒素TT（蓝色）和脱毒后的破伤风类毒素（绿色）MALS典型图谱（对应于AF4图谱中的Peak2）^[3]

3· 质量肽图与翻译后修饰研究

破伤风类毒素（TT）蛋白经◎变性、还原、烷基化、Trypsin酶切及LC-MS分析后，可鉴定到TT各肽段的信息，样品原始序列见图↘5。

图5 破伤风类毒素（TT）理论氨基酸序列^[4]

破伤风类毒素（TT）蛋白的翻译㊣后修饰，除常〗规的氧化，脱酰胺修饰外，还存在C、H、K、R、Q、W、D等位点上发生甲醇加合物（+30.011Da），K上发生席夫碱加合物（+12.000Da）。文献[3]中所检的破伤风类毒素样々品，部分位点发生的修饰列举如下图6所示。

图6 破伤风类毒素（TT）翻译后修饰结果^[3]

4· 氨基酸序列覆盖率研究

破伤风类毒素（TT）理论↑序列如上图5所示，N端以氨基酸■P开始。成熟的破伤风类毒素蛋白会丢失N端氨基酸M，共含1314个氨基酸，可以使用高分辨质谱对TT蛋白的序列进行确认，也可以结合氨基酸组成等技术手段进行蛋白序列的正交确证。

5· 二硫∞键连接方式研究

依据文献理论序列^[4]，破伤风类毒素理论上含两对二硫键，L-Chain与H-Chain间依靠二硫键（Cys438- Cys466）连接，另一条二硫键为链内二☆硫键（Cys1076- Cys1092），可以通过高分辨质谱LC-MS/MS的分析研究，对TT蛋白的理论两条二硫键进行确认。

6· 氨基酸组成/消光→系数研究

对破伤风类毒素蛋白质样品进行酸水解，形成游离氨基※酸，用PITC对游离氨基酸进行衍生化处理，然后使用高效液相色谱对衍生化的氨基酸样品进行分析，可以对TT蛋白的氨基酸组⌒成及消光系数进行分析研究。液相▲色谱图如图7所示。

图7 破伤风类毒素（TT）液相色谱图

7· 圆二色性研究

一般情况下，蛋白质具有圆二『色性，不同二㊣　级结构的蛋白质所产生CD谱带的位置、吸收的强弱都不相同。

远紫外扫描图谱主要反映肽键的圆二色性，在蛋白质或多肽的规则二级结构中，肽★键是高度有规律排列的，其排列的方向性决定了肽键能级跃迁的分裂情况，可以根据二级结构图谱及软件拟合，估算供试品的二级结ξ构比例。近紫外∮扫描图谱，反映Trp、Tyr和Phe及二硫键所处微环境〓的扰动，能应用于研究蛋白质三级结构的精细变化。破伤风类毒素（TT）的远紫外典型图谱如图8所示。

图8 破伤风类毒素（TT）远紫外CD图谱

8· 热稳定性☉研究

差示扫描微量热法（DSC）是一种可表征蛋白质和其他生物分子热稳定性的检测，热分析法是Ψ研究物质受热过程所发生的晶型转变◥、熔融、蒸发等物理∴变化或热分解、氧化等化学变化以及伴随发生的温度、能量或重量改变的方法。本实验通过差示扫ぷ描量热法（DSC）检测供试品的中间相转变温度（Tm）值▓和起始变性温度（Tonset）值。Tm是热稳定性的指标，一般情况下，Tm越高，蛋白质越稳定。破伤风类毒素（TT）的Tm值测定典型图谱如图9所示。